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抗生素耐药蛋白的机理研究

发布时间:2018/02/09 成功案例 标签:Autodock催化机理分子对接相互作用耐药机制酶催化浏览次数:3151

细菌耐药机制探索——MCR-3酶催化水解PEA的机理

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合作单位:中国农业大学

基金支持:国家自然科学基金(No.31602107,No.81661138002)

合作成果Antimicrob. agents ch., 2018, doi: 10.1128/AAC.00366-18. (2017 IF = 4.255)

 

粘菌素是一种强力的抗生素,通常作为抗“超级细菌”的最后一道屏障。目前,对粘菌素耐药的细菌体内存在移动粘菌素抗性基因(Mobilized colistin resistance, MCR),编码的MCR-3蛋白是一种磷酸乙醇胺转移酶。本文采用分子模拟方法预测了细菌利用MCR-3蛋白催化底物水解导致耐药的分子机制,合作单位通过氨基酸突变实验验证了预测结果的可靠性。

 

1 背景知识

粘菌素(Colistin)又称多粘菌素(Polymyxin)E,作为抗“超级细菌”的最后一道屏障,其结构中包含聚阳离子环,可以插入磷脂分子层并破坏细胞膜的完整性。但是,已经有报道发现了具有对粘菌素耐药的细菌出现,这些细菌体内均含有移动粘菌素抗性基因(Mobilized colistin resistance, MCR),而粘菌素耐药蛋白MCR-3是MCR基因编码的一种磷酸乙醇胺(Phosphorylethanolamine, PEA)转移酶。目前认为MCR-3主要通过增加细胞膜表面带正电的磷酸乙醇胺的含量,导致细胞膜表面对带正电荷的黏菌素吸附性降低,引起细菌对粘菌素的耐药性。

 

2 实验结果

合作单位首先通过ESI-QTOF/MS实验证明了MCR-3能够修饰底物磷脂酰乙醇胺(Phosphatidylethanolamine, PEA),如图1所示。在MCR-3中加入PEA之后,主峰从m/z 1797移动到了m/z 1920,正好是PEA的分子量(123 Da)。但由于缺少分子结构及其它相关实验研究,相关的催化耐药机制无法得到,且无法精准突变实验证实相关结合位点。

图1 MCR-3对细菌脂质A修饰作用的ESI-QTOF/MS分析。[图片源于Antimicrob. agents ch., 2018, doi: 10.1128/AAC.00366-18.]

 

3 方案设计

根据以上实验结果,经与合作单位商讨,我们设计了如下模拟方案来研究MCR-3催化底物L-α-磷脂酰乙醇胺(L-α-phosphatidylethanolamine, L-αPEA)的分子机制:

  1. 同源模建构建MCR-3蛋白质的三维结构;
  2. 采用分子对接方法获取MCR-3与L-αPEA的结合模式;
  3. 采用分子力学方法优化复合物的结构;
  4. 基于复合物结构分析结合模型、催化机制、关键氨基酸。

 

3.1 MCR-3蛋白结构

通过同源建模方法构建得到了MCR-3蛋白的结构,如图2所示。MCR-3的结构主要由两部分组成,分别是N-端的跨膜区域(Transmembrane domain)和C-端的可溶性胞质区域(Soluble periplasmic-facing domain),它们由一段α螺旋和loop区连接。其中,可溶性胞质区域具有与水解酶活性中心类似的结构[1],而Zn2+结合到活性位点并与Glu238、Thr277、Asp450和His451形成四面体配位结构,距离分别为1.9、2.2、2.0和1.9 Å。

图2 同源建模得到的MCR-3蛋白的三维结构(单位:Å)。[图片源于Antimicrob. agents ch., 2018, doi: 10.1128/AAC.00366-18.]

 

3.2 MCR-3PEA的分子对接

将底物L-αPEA对接到上一步构建的MCR-3的催化活性空腔,分子对接得到的结构进一步采用分子力学进行优化,后续使用优化后的结构进行分析。所有计算均在MolDesigner分子模拟平台(MolDesigner molecular simulation platform)上完成。MCR-3与底物L-αPEA的结合模式如图3所示,PEA能够与MCR-3的活性空腔较好地结合,结合能为-7.1 kcal/mol,氢键和疏水作用是二者结合的主要驱动力。从二者的结合模式可以发现,PEA磷酸基团的O1与催化中心的Zn2+距离为2.7 Å,磷酸基团的P与Thr277羟基O原子距离为3.1 Å,表明两对原子可能在静电作用下分别形成O1—Zn2+配位键和P—OThr277共价键,进而共价修饰该蛋白。

图3 L-αPEA与MCR-3活性位点的相互作用。[图片源于Antimicrob. agents ch., 2018, doi: 10.1128/AAC.00366-18.]

 

3.3 催化机制探讨

根据上述对接结果,结合相关MCR蛋白的催化机理[3]。本文对MCR-3催化L-αPEA可能的机理进行了推测。如图4所示,反应主要分为两步进行:1)MCR-3中具有催化活性的Thr277侧链羟基上的氢质子通过水分子转移到His463残基侧链的氮上,Thr277进而被激活成为具有亲核进攻能力的基团,质子化的His463在后续可以作为氢质子的供体参与后续反应。同时,Glu238的羧酸根会吸引Asp321的羧基氢质子转移到Glu238上,使得催化中心保持电中性。2)L-αPEA结合到催化活性位点,其磷酸基团中的O1会与Zn形成配位键结合,P与Thr277的羟基氧形成共价键,同时末端烷基侧链的O2与P共价键断开,并接收His463的氢质子,形成醇后脱去,最终L-αPEA与MCR-3酶形成Thr-PEA的复合物。

图4 MCR-3催化PEA的反应机理推测。[图片源于Antimicrob. agents ch., 2018, doi: 10.1128/AAC.00366-18.]

 

4 突变实验

考虑到Thr277在上述催化过程中的关键作用,对该氨基酸的突变将会导致MCR-3活性降低。为了验证这种猜想,合作单位对MCR-3进行了突变实验(Thr277Ala和Thr277Ser)。MIC实验如表1所示,从表中可以看出,Thr277突变之后,黏菌素和多粘菌素的MIC值均明显降低。突变结果表明,Thr277氨基酸在MCR-3催化修饰脂质A的过程中具有关键性的作用,并佐证了分子对接预测的结合模型和催化机制的准确性。

 

表1 Colistin和Polymyxin对MCR-3野生型和突变体的MIC值

[数据源于Antimicrob. agents ch., 2018, doi: 10.1128/AAC.00366-18.]

参考文献

  • Natl. Acad. Sci. USA, 2017, 114(9), 2218-2223.
  • Comput. Chem., 2009, 31(2), 455-461.
  • Mol. Bio., 2013, 425(18), 3389-3402.
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