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牛布氏杆菌某合成酶新型抑制剂的筛选

发布时间:2018/06/27 成功案例 浏览次数:1349

牛布氏杆菌苏氨酰-tRNA合成酶新型抑制剂的筛选

——基于蛋白结构筛选抗耐药菌先导化合物


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合作单位:中国农业科学院北京畜牧兽医研究所

合作成果

  1. Exploring the Molecular Basis for Binding of Inhibitors by Threonyl-tRNA Synthetase from Brucella abortus: A Virtual Screening Study. Int. J. Mol. Sci. 17(7).1422-0067. (2016 IF=3.226)
  2. 发明专利:一种牛布氏杆菌苏氨酰-tRNA合成酶新型抑制剂的筛选方法,申请中。

摘要:本文主要讲述了牛布氏杆菌新型抑制剂的筛选过程。我们与北京畜牧兽医研究所奶业创新团队合作,对牛布氏杆菌苏氨酰-tRNA合成酶进行同源建模、模型结构优化、活性中心搜索,最终针对ZINC化合物库进行了基于分子对接的虚拟筛选。经打分排序和人工目筛,确定购买综合排序前50位的去重、可购买分子,共35个,然后用细菌生长抑制试验验证分子活性。最后,我们得到了一系列骨架不同的活性分子,筛选成功率高达11.4%

1 背景知识

布氏杆菌在全球范围是重要的人畜共患病致病菌[1]。牛布氏杆菌能够引起牛布氏杆菌病,不但对全世界畜牧业的发展造成严重危害,而且对许多发展中国家和不发达国家的人民健康都是重大威胁[2]。庆大霉素是最早用于布氏杆菌病治疗的药物[3]。然而,该抗生素的治疗周期比较长,而且具有剧烈的副作用。因此,作用于牛布氏杆菌新型蛋白靶标的新型抗生素的开发迫在眉睫。

2 方案设计

以牛布氏杆菌苏氨酰tRNA合成酶(ThrRS)为靶标研发针对牛布氏杆菌病小分子药物是一种十分有前景的方法[4-5]。本研究的具体路线图如图 1所示。

图 1实验的流程图

首先,通过同源建模方法构建了牛布氏杆菌ThrRS(BaThrRS)的3D结构。由于大肠杆菌的ThrRS(PDB ID 1QF6)在氨基酸水平上与BaThrRS具有51%的同源性,所以选取大肠杆菌的ThrRS为模板,并利用分子动力学模拟优化,最终得到了一个可靠的结构。为了查找与底物ATP结合的重要氨基酸残基,我们序列比对和分子对接鉴定了底物ATP在BaThrRS上的结合区域。接着,我们将ATP的结合位点用于BaThrRS抑制剂的虚拟筛选,最终得到了7种前导化合物。这7种化合物的选择是基于结合自由能比ThrRS已知选择性抑制剂borrelidin的结合自由能(-9.3 kcal/mol)小。最后,我们进一步鉴定了抑制活性最高的化合物ZINC27215482与BaThrRS的结合位点。

2.1 牛布氏杆菌苏氨酰tRNA合成酶的同源建模

如图 2所示,利用序列比对和同源建模得到牛布氏杆菌苏氨酰tRNA合成酶初步的三维结构模型。

图 2牛布氏杆菌苏氨酰tRNA合成酶与大肠杆菌氨基酸序列比对

2.2 牛布氏杆菌苏氨酰tRNA合成酶三维模型的优化

对牛布氏杆菌苏氨酰tRNA合成酶三维模型进行20 ns分子动力学模拟。结构优化后,模型的各项参数如表 1所示。表明优化后的牛布氏杆菌苏氨酰tRNA合成酶三维模型更加合理,更加适合基于分子对接的虚拟筛选。

表 1牛布氏杆菌苏氨酰tRNA合成酶三维模型优化后的各项参数

2.3 牛布氏杆菌苏氨酰tRNA合成酶结合位点的确认

分子对接关键步骤——靶蛋白结合位点的确定。将已知晶体结构苏氨酰tRNA合成酶活性位点与牛布氏杆菌进行比较,如表 2所示,发现牛布氏杆菌苏氨酰tRNA合成酶结合位点由以下氨基酸组成:Cys343、Arg372、Glu374、Met383、Arg384、Val385、Phe388、Gln390、His394、Gln493、Cys494、Thr496、His525、Gly530、Ser531、Arg534。取上述氨基酸围成球体中心为分子对接的活性中心。

表 2已知晶体结构苏氨酰tRNA合成酶活性位点与牛布氏杆菌的比较

2.4 虚拟筛选实验

虚拟筛选(Virtual screening)能够大大缩短药物研发的周期,是药物发现的一种常用技术。本课题采用基于分子对接的虚拟筛选技术,其基本思路是通过计算化合物库中小分子与靶蛋白的亲和力强弱,来预测候选化合物的生物活性。

在确定牛布氏杆菌苏氨酰tRNA合成酶结合位点之后,我们采用虚拟筛选和人工目筛结合的方法,对ZINC库中天然产物数据库(11,247种化合物)进行筛选,得到与牛布氏杆菌苏氨酰tRNA合成酶具有潜在亲和力的前50个候选化合物,进行购买。通过去除重复以及不可购买的化合物,最终得到35个候选化合物,用于后续活性验证。

2.5 生物活性实验验证

得到上述候选化合物之后,采用菌体生长抑制试验,分别检测了35个化合物对牛布氏杆菌的生长抑制作用。结果显示4个化合物具有活性,占比11.4%(此部分数据尚未发表)。

3 展望

发现新型抗菌药物的前提是发现新型抗菌化合物,基于牛布氏杆菌苏氨酰tRNA合成酶新靶点,进行新型抗菌化合物的研究和开发,进一步研究和开发出拥有我国自主知识产权的新型抗菌药物,具有重大意义和应用前景。

参考文献

[1] In vitro bactericidal activity of aminoglycosides, including the next-generation drug plazomicin, against Brucella spp. Int. J. Antimicrob. Agents 2015, 45, 76–78.

[2] Cloning, characterization, and inhibition studies of a beta-carbonic anhydrase from Brucella suis. J. Med. Chem. 2010, 53, 2277–2285.

[3] Perspectives for the treatment of brucellosis in the 21st century: The Ioannina recommendations. PLoS Med. 2007, 4, e317.

[4] Aminoacyl-tRNA synthetase inhibitors as potent and synergistic immunosuppressants. J. Med. Chem. 2008, 51, 3020–3029.

[5] Aminoacyl tRNA synthetases as targets for antibiotic development. Med. Chem. Commun. 2012, 3, 887–898.

 

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